養殖與種植專家-農業戶網
>您當前的位置:首頁 > 生物

禽法氏囊三肽囊素免疫生物學及其同功能單鏈抗體研究進展

時間:2015-01-14 17:39:56  來源:  作者:鄔向東; 諶南輝

從1988年Bird第一次報道大腸桿菌能正確地裝配抗體的Fab和Fy片段并使之保留原抗體的特異性,至今利用基因工程技術構建單鏈抗體基因,已經是相當成熟的技術;但在動物醫學領域仍鮮有研究,而無病原因子污染的方式生產出Bursin-ScFv應是該研究的發展方向。

1 禽法氏囊及其功能 法氏囊(BF)是禽類特有的免疫器官,是意大利解剖學家FabriciusH所發現,故稱法氏囊。它位于禽類泄殖腔的背側后上方,又稱為腔上囊。BF為B細胞發育、成熟提供微環境,是禽類特有的免疫球蛋白基因轉變(Geneconversion)場所,由此獲得抗體的多樣性。BF除具有中樞免疫器官地位外,還作為外周免疫器官發揮作用。1996年張紅衛等以手術摘除法獲得無BF仔雞,研究雞脾臟B細胞的發育,結果證明鳥類脾臟B細胞主要來源于BF。來自骨髓的多功能干細胞,經血流進入法氏囊后,在稱為囊素(bursin)的誘導下,分化成為囊依賴性淋巴細胞簡稱B細胞,經淋巴和血液的循環移至外周免疫器官的非胸腺依賴區并繼續增殖,參與體液免疫。據研究證實,囊激素為一種三肽物質,分子結構為Lys-His-Gly-NH2,故又稱為三肽囊素(Bursin)。

2 禽法氏囊免疫活性物質研究 關于BF中免疫活性因子的研究,1960年Glick等首次發現法氏囊提取液(BE)能提高雛雞對綿羊紅細胞產生的抗體水平。1976年Baba等發現BE能夠使胚胎期切除法氏囊的雛雞法氏囊復生,并恢復產生特異性抗體和免疫球蛋白。1977年Baba等又報道了法氏囊提取液可恢復丙酸睪酮(TP)抑制BF發育雞的抗體水平及IgG;的生成能力。1976年,Brand等由體外實驗研究雞骨髓干細胞的早期分化,證實BE可誘導B細胞和T細胞的分化,用其低濃度亦可很強地引起B細胞發生分化,其化學成分為低分子多肽,稱其為Bursopoietin。1981年高舜德等亦進行了BE對BF復生的研究,結果表明BE注射愈早,對BF的復生作用愈大,從而證明BE有促使BF發生的作用。1993年王興金等亦證實BE經口服或肌注,均顯著提高雞產生特異性抗體的能力,并能對環磷酰胺(CP)造成的免疫抑制有明顯的拮抗作用,其免疫增強作用與BE的劑量相關。另外,1991年鄭昌學、高奮標從北京鴨BF中獲得的提取物能顯著提高小鼠脾臟內空斑形成細胞(PFC)數目,還具有對抗B細胞抑制劑CP的作用,能提高小鼠脾細胞cAMP含量,以及具有增多胸腺細胞E-玫瑰花環形成數目的活性,并稱其為Bursatin,經分析很可能是肽類物質;從Bursatin部分純化的促PFC的活性因子的分子量小于750kDa。1996年李從壁等以高于正常免疫劑量5倍的法氏囊炎疫苗免疫二次,于免疫高峰時提出BF,自BF中分離出一種分子量小于10kDa的物質,為多肽和核苷酸的混合物,稱為免疫法氏囊活性因子,理化性質類似于轉移因子,具有促進淋巴細胞增殖,特別是T細胞活性的功能,有依賴抗原的特異免疫活性。

3 三肽囊素(Bursin)研究進展 1986年AudhyaT等首次從雞BF抽提液中純化出定名為Bursin的物質,其化學組成為三肽,即賴氨酰-組氨酰-甘氨酰胺(Lysyl-Histidyl-Glycyl-Amide)。其生物功能顯示,能誘導家禽和哺乳動物B細胞前體分化,能提高人B細胞系Daudi細胞內cAMP和cGMP水平,而對人T細胞系CEM卻無上述活性作用這項研究成果對BF中免疫活性因子的研究具有十分重要的意義,這是迄今為止第一個自BF中分離出有關誘導B細胞分化能明確其結構的因子,確定為B細胞選擇性分化激素。隨后,1989年GI Viamontes等制備出抗Bursin抗血清,以免疫組化法,確定Bursin分布于BF濾泡皮髓質分界上皮(CME)、樹狀網狀上皮細胞(DREC)及濾泡表面上皮(WSE)基底膜中,而其他器官為陰性。至1990年TAudya等有新的發現,證實Bursin不僅存在于鳥類BF上皮中,還存在于鳥類、哺乳類骨髓以及哺乳類肝臟膽管上皮細胞中;又于1991年自牛骨髓和肝臟分離出前囊素(Probursin),為十四肽結構(Phe-Phe-Trp-Lvs-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg),其順序9~11卻與Bursin一致,且具有Bursin相同的生物學活 性。早于1973年LPickart等自大鼠肝臟分離出一種增殖因子,具有與Bursin類似的三肽結構(Gly-His-Lys)。 1997年諶南輝等建立抗Bursin單抗2F9-4株,以該單抗,用免疫組化法,檢測Bursin在雞體的定位分布,結果表明,Bursin不僅分布于BF,且廣泛性存在于胸腺Hassa U小體、哈德氏腺、脾臟、BFT細胞區及骨髓;亦不僅在出雛后,且于胚胎期呈陽性結果。由此表明,Bursin不僅局限于BF的范疇,也不局限于禽類,因而具有更為廣泛的免疫生物學意義,特別是對功能至今仍不完全清楚的胸腺Hassall小體賦予了新的概念和傳遞了新的信息。 1997年大坪裕子等對CB雞胚胎期BF淋巴濾泡形成的研究,發現Bursin在間充質的定位早于B細胞分化標記Bu-1(ChB6)陽性細胞出現之前,因而推測Bursin在間充質中的定位對B細胞在濾泡中分化顯示出有意義的影響。 1998年張秀根等改進了以往制備BE的方法,制備出分子量更接近三肽的活性物質,并證實該物質的靶器官是BF,能夠拮抗IBD疫苗對BF的損傷,能顯著提高ND弱毒疫苗及油苗產生的抗體水平,促使母源抗體保持較高水平,促進BF生長發育,以及促進損傷后的BF的修復。 1999年張秀根等進一步證實人工合成純Bursin作用的靶器官是BF,促進BF生長發育,促進特異性抗體的產生,維持母源抗體的作用;其作用在應用早期比晚期強。1999年王川慶等在IBD疫苗、ND疫苗中試用人工合成純Bursin,結果表明,可提高ND的抗體水平2個滴度以上,攻毒保護率達100%,對IBD除可促進抗體的產生外,還能提高攻毒保護率20%,并能減輕強毒IBDV攻擊所造成的BF損傷。研究結果還表明,Bursin主要通過刺激BF淋巴細胞濾泡及其淋巴細胞的發育、增生,提高抗體產生水平、促進T淋巴細胞的轉化活性等而發揮其提高機體免疫力,增強免疫效果的作用。

4 三肽囊素同功能單鏈抗體(Bursin-Single ChainFv,Bursin-ScFy)研究前景 三肽囊素(Bursin)的生物學功能目前已經得到大多數學者的認可,未來幾年中,三肽囊素(Bursin)在家禽生產中的應用將成為新的熱點。但目前對于三肽囊素(Bursin)的獲得還僅限于物理提純和化學合成,這些方法要么因需避免病原污染而要使用來自SPF雞群的BF;要么人工合成。其成本必定很高,造價昂貴而影響生產中的應用。而應用基因工程抗體技術來大規模生產,肯定是其未來發展的方向。構建三肽囊素同功能單鏈抗體(Bursin-ScFv)就是其中方法之一。

4.1 抗獨特型抗體理論及實踐應用 抗獨特型抗體是本世紀70年代后期發展起來的一種新型免疫生物制劑。其理論根據是,機體針對抗原性物質產生的抗體(Abl)具有雙重性,其抗原結合段(Fab片段)做為抗體可識別抗原,而做為抗原,它又可刺激免疫活性細胞產生抗Abl的抗體(Ab2),因此Abl又可被Ab2所識別,通常便把Ab2稱為抗獨特型抗體,這種抗獨特型抗體具有始動抗原性物質的作用,是因為它們之間具有相似的三維空間折疊結構(即相同的內映像),攜帶著與天然抗原一樣的決定基,給動物注射后,便可產生天然物質相同的生物學功能作用。目前應用這項技術除主要適用于制造疫苗外,還可進行生物受體(包括激素、維生素、神經遞質、病毒受體)的研究等。

4.2 單鏈抗體(SingleChainFv,ScFv)特性 1988年Bird等第一次報道,大腸桿菌能正確地裝配抗體的Fab和Fy(由抗體重鏈、輕鏈可變區構成,即由VH和VL構成)片段并使之保留原抗體的特異性。組成Fv片段的VH、VL是靠非共價鍵聯系結合在一起的,同時缺乏任何鏈間二硫鍵,因而盡管有高度保守的可變區骨架序列,Fv異源二聚體片段的穩定性變化很大,易分解成VH和VL分子,而喪失其功能。為此通過人工合成或天然的連接肽序列將VH和VL共價連接起來,形成較高穩定性的單鏈抗體片段,即VH-Linker-VL或VL-Linker-VH的順序組成。實驗證明,15個氨基酸的連接肽效果最好。這種基因工程抗體,不但可以克服異源性,減少免疫原性,還由于分子量小,可以克服機體的天然屏障,進入組織內發揮作用,且仍保持特異性,是理想的導向載體。

4.3 具三肽囊素同功能單鏈抗體(Bursin-ScFv)研究前景 利用基因工程技術構建Bursin-ScFv基因,然后整合于適當的表達系統中進行表達,就可以通過物質發酵技術大規模地生產,獲得大量Bursin-ScFv應用于實踐。 目前ScFv在表達方面,已經有很多成功的例子:Eldin等1997年用畢赤酵母(Pichia pastoris)表達ScFv獲得成功,其表達產量較大腸桿菌系統更高,達250mg/L,而且其表達的可溶性ScFv可以正常分泌至培養物上清液中,其純化產物與細菌表達的ScFv親和性無區別。國內王字玲等于1998年成功地進行了黑色素瘤特異性McAb HB8760單鏈抗體的基因表達;武國軍等E26]在2000年成功對抗前列腺特異性抗原單鏈抗體/人羧肽酶A融合基因的克隆表達載體pGEX-4T-1中進行表達,表達量達到菌體總蛋白的34%;王長軍等在2001年將抗人紅細胞血型A抗原單鏈抗體進行原核表達獲得成功,其表達產物主要以不容性包涵體形式存在,光密度掃描結果表明,重組蛋白占菌體蛋白的16.2%,免疫印跡試驗顯示,重組小分子抗體保留了親本單克隆抗體的特異性親和力。 由此可見,Bursin-ScFv前景十分可觀,經基因工程技術構建并克隆出Bursin-ScFv基因,經過整合載體轉化到受體細胞進行高效表達,就可既克服異源性,減少免疫原性,以低成本,無病原因子污染的方式生產出Bursin-ScFv,從而可大量供應生產和需要。

    共有條評論發表評論
    用戶名: 密碼:
    驗證碼: 匿名發表
    CopyRight 農業戶 http://www.vvouax.live 版權所有
    吉ICP備11001780號-1
    体彩快乐扑克投注