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A型流感病毒蛋白研究進展

時間:2015-01-14 17:33:21  來源:  作者:劉紅旗; 劉秀梵; 張如寬

A型流感病毒是鳥類、人類和低等哺乳動物的嚴重疾病的病原。Smith等人于1933年首次將從人體中所分離到的流感病毒稱之為A型流感病毒。Perroncito記述的1878年意大利爆發的雞瘟,1955年證實也是由A型流感病毒引起的。20世紀人類流感曾發生過3次瘟疫性的全球大流行:1918-1919年的"西班牙流感"、1957~1958年的"亞洲流感"和1968~1969年的"香港流感",死亡人數達2 000多萬。禽流感自1878年在意大利首次發現至今,由于候鳥的遷徙和國際間禽類貿易的日益頻繁,使得該病呈全球性分布,給養禽業造成巨大的經濟損失,特別是1997年"香港禽流感"事件的發生,更加引起國際科技界的極大關注。許多學者對此病展開了深入廣泛的研究,在各個方面取得了很大的進展。現代分子生物學認為:基因作為唯一能夠自主復制、永久存在的單位,其生理學功能是以蛋白質的形式表達出來的。本文就A型流感病毒蛋白的結構和功能方面的研究進展作一綜述,以期促進對流感的更好的研究和控制。 A型流感病毒是正粘病毒科的重要成員,是8節段的負鏈單股RNA病毒,共編碼10個多肽。節段1和2分別編碼多聚酶蛋白PB2和PBl;節段3編碼PA蛋白,也與聚合酶活性有關;節段4編碼血凝素蛋白HA節段5編碼核衣殼蛋白NP;節段6編碼神經氨酸酶NA;節段7編碼基質蛋白M1、M2和M3(?),可能作為支架蛋白,與病毒的形態有關;節段8編碼非結構蛋白NSl和NS2,可能參與病毒基因組的轉錄,具體情況見表。

1 血凝素蛋白 流感病毒血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)是構成流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,為桿球形蛋白分子,4μm×14μm,在電鏡下可形成星狀聚合物。HA為75K糖蛋白,是I型膜蛋白。流感病毒的HA包括3個高度保守的半胱氨酸殘基。 靠近HA2亞單位羧基端棕櫚化位點。功能性的HA是由3個非共價結合的HAl和HA2肽鏈所組成。 HA首先是作為單一多肽(H0)被合成,兩個肽鏈由二硫鍵連接在一起。HAl形成HA纖突的球狀部分,攜帶有受體結合位點,該位點的突變有可能改變宿主的特異性,N端有一信號肽,HAl含有毒粒的大部分糖分子,它形成突起的頂端,其寡糖的量占蛋白的20%,是由一些氨基葡萄糖所組成,它通過N-葡萄糖苷鏈與蛋白的Asp相連合,一些甘露糖則形成枝狀結構。此外,還有少量的一種脫氧-巖藻糖(Fucose)。正是由于在病毒的外膜有這些糖類,所以,所有流感病毒對細胞的表面多糖有親和力,HA通過與細胞表面的唾液酸糖連接區來介導病毒吸附到細胞表面。HA2的N末端有一疏水性的融合肽。HA2的中間部分富含。螺旋,形成HA胞外域的頸。跨膜域和胞漿域位于HA2的C端。在HA2的C端有一疏水區,它是穿膜部分,插入毒粒的雙層類脂膜中,在病毒囊膜和細胞膜之間形成一個通道,使兩膜融合病毒核酸得以入侵宿主細胞。 HA水解成HAl和HA2,是感染的先決條件,水解后則去除連接肽或單一Arg。這在不同的宿主細胞是不同的。因此,HA對細胞蛋白酶的易感性和這些酶在宿主組織里的分布是病毒泛嗜性的決定因素。最近的研究表明,禽流感和人流感的毒力機制稍有不同:禽誘導下變為具有融合活性的構象。羅漢松酸相關的復合物通過與A型流感病毒的中性pH構象相互作用,可以阻止低pH誘導HA變為融合性構象。胞漿域由10~11個氨基酸組成,其中5個氨基酸殘基在A型流感病毒的所有亞型中都是保守的。HA胞漿尾的脂肪酸對孔的形成是必須的。乙酰化位點的減少可阻止HAl亞型感染性病毒的形成。去乙酰化作用不會影響膜的融合和融合孔的形成,但可抑制合胞體的形成。胞漿尾通過干擾脂肪層跨膜域的自由移動來下調融合作用,且其大小和疏水性對這一作用的發揮相當重要。

2 神經氨酸酶 神經氨酸酶(Neuraminidase,NA)也是流感病毒胞膜的糖蛋白。電鏡下,NA突起為10μm長的纖維,在其末端有一個大小不等的較大的結構,其分離物易形成花瓣樣結構。每個NA突起為200kDa,它是兩個不同的由二硫鍵連接的55kDa糖蛋白的二聚物,即由4個單體NA所組成,每個單體由一些(-折疊所組成,排列成螺旋槳狀,環繞著唾液酸結合位點。NA為Ⅱ型膜蛋白。NA在毒粒的胞膜上似蘑菇狀,有一短柄,N'端有一疏水區,它插入毒粒的雙層類脂膜,可能也作為信號肽。 NA是一種外切糖苷酶,可裂解唾液酸和附近的糖殘基之間的A糖苷鍵,使子代病毒釋放出來,還可防止病毒之間的聚集。正是由于這一作用,0℃發生的血凝現象,在37℃就逐漸逆轉,也就是說,在37℃,NA裂解了使病毒賴以組合的細胞膜的受體。但是,目前也有人認為,NA的功能是去除裸露糖蛋白末端的唾液酸,這樣可以加速病毒的芽生,使毒粒從受染細胞釋放出來,這一作用對感染的擴散,也起重要作用。NA抗體可以抑制酶活性,但不能中和感染力。唾液酸復合物可限制組織培養里的流感病毒的復制。經過進一步修飾的唾液酸可成為流感病毒NA的高親和性和高特異性的抑制劑。4-鳥嘌啉-2,4-二脫氧-2,3-二脫氫-N-乙酰-神經氨酸(Zanamivir)是唾液酸非飽和類似物,為NA特異性的抑制劑,其鳥嘌啉可以取代唾液酸C4上的羥基。 最新研究表明,NA通過連接和隔離纖維蛋白酶原,提高這種泛在性蛋白酶前體的局部濃度,從而提高HA的裂解性。NA分子的這種不尋常的功能的結構基礎是C端的賴氨酸和146位氨基酸殘基缺少一寡糖側鏈。這些結果表明,對人類來說A型流感病毒(可能其他的一些病毒)都可以通過一種方式變為高致病性。遺傳學研究表明,A/WSN/33(H1N10)的NA分子對HA的裂解起關鍵作用,從而導致病毒的泛嗜性。Lazarowitz等的研究表明,在缺少外源性胰酶的細胞中,血漿纖維蛋白溶酶原是負責WSN的HA裂解的蛋白酶的主要來源。由于NA的C末端有一賴氨酸且其146位氨基酸殘基缺少一寡糖側鏈,因此,胞漿纖維蛋白溶酶原可以連接到NA上,然后轉變為胞漿素,胞漿素可以將HA裂解為HAl和HA2。如果病毒出芽時,細胞缺少胞漿纖維蛋白溶酶原激活劑或者其濃度很低時,那么HA就不能裂解,直到病毒連接到表達適當的胞漿纖維蛋白溶酶原激活劑。

3 核蛋白 核蛋白(Nucleoprotein,NP)是一種單體磷酸化的多肽,分子量約60kDa,它是構成病毒核衣殼的主要蛋白成分。核蛋白具有型特異性,根據其抗原性的不同,可將流感病毒分為A、B、C三型。核蛋白是一種多功能蛋白,除了形成病毒的核衣殼外,在病毒基因組的轉錄和復制中也可能起作用。核蛋白的磷酸化取決于宿主細胞,與病毒感染的宿主譜有關。核蛋白分子至少具有3個獨立的抗原位點,通過用單克隆抗體和多克隆抗體進行研究,發現所有被測毒株中都有一個共同的位點,但針對這一位點的單抗可抑制病毒RNA分子的體外轉錄。針對核蛋白的單克隆抗體不能給動物提供被動保護,用提純的核蛋白免疫動物,也只能產生很微弱的抗感染能力,但NP是細胞毒性淋巴細胞識別的主要抗原。

4 聚合酶 流感病毒RNA聚合酶由PBl-PB2-PA三個亞單位構成,參與RNA基因組的轉錄和復制。亞單位PBl可與核甘酸底物相連,其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐漸延長;在模板RNA和病毒RNA的合成過程中也靠PBl的作用使合成鏈增長。PBl攜帶有RNA和DNA聚合酶的保守序列,PBl的SDD序列對RNA的合成是必要的,PBl上還有兩個核甘酸結合域。PB2在病毒mRNA轉錄的起始階段,識別并結合在5端I型帽狀結構;PB2的重要功能是作為一種核酸外切酶可特異性地裂解帶帽的mRNAc~。PB2在體外可與I型帽狀結構的類似物以及沒有PB2且缺少5-帽結構的細胞合成的RNA相連,這些表明PB2對帽狀結構的攝取是必要的。PA在病毒RNA轉錄和復制過程中,與PBl和PB2在一起隨鏈的延長而移動,因此推測PA與PBl和PB2共同構成RNA聚合酶復合體。近來,Nakagawa等的研究表明,PA對依賴cRNA的vRNA的合成是必要的。

5 基質蛋白 流感病毒基質蛋白(Matrix,M)M1是一種多功能因子,其參與病毒生活周期的幾個環節,除了作為病毒子的結構蛋白外,M1還有重要的調節功能,如:控制病毒的轉錄和被感染細胞的胞核胞漿之間的物質運輸。這種具有抑制病毒的轉錄活性的部位位于M1蛋白的氨基端,分別為1-90位氨基酸殘基和91~127位氨基酸殘基之間。 M1表現為膜連接和RNA連接能力,這兩個作用都參與病毒的裝配。M1通過直接與RNP核接觸來介導抑制流感轉錄酶的活性。近來報道的M1的原子結構表明,M1與RNA的連接主要通過與91,98,101,102和105位的堿性氨基酸以及聚合結構上的類似物之間的靜電相互作用。Watanabe等表明,RNP核抑制轉錄的活性需要M1上9l一111位氨基酸殘基的RNA結合域,這一區域組成了核靶信號(NLS)和M1蛋白的寡聚作用結構域。 A型流感病毒通過膜融合作用進入細胞,病毒核衣殼也進入胞漿,這時M1蛋白從核衣殼分離,M1使RNP復合物運輸到基因組轉錄和復制的部位一-細胞核。在細胞核里,RNP積極地參與轉錄和復制,分別產生病毒mRNA和子代基因組RNA(vRNA)。病毒感染的后半段時間,通常從感染后4h開始,所有的病毒mRNA的合成急劇減少。這時,為滿足子代病毒粒子的裝配,聚合酶復合物的生物活性幾乎完全轉向基因組vRNA的合成。這種轉錄和復制的解偶聯現象是由于M1蛋白的作用。感染后期,M1的積累通過聚合酶復合體來抑制mRNA的合成。從原核生物表達系統純化的M1可得到同樣的結果,盡管其有聚集的傾向。因為體內病毒復制的后期階段M1的積累可阻止病毒mRNA的產生,所以認為這種抑制作用在體內也存在。M1胞漿池限制新產生的RNP向核運輸,而核內的M1則促進RNP從核內輸出。對M1功能產生巨大影響的唯一的翻譯后化學修飾是磷酸化,可能影響M1的促核內RNP運出的活性D3)。除了這兩個主要的M1池外,還有一個次要的M1池,與進入胞漿啟動感染的核衣殼有關。將病毒子暴露于內核體的酸性環境里,M1與核衣殼之間的作用發生改變,核衣殼失去M1后就進入細胞核。M1的這種隨pH變化而改變其自身結構的能力對其功能的發揮是非常重要的。M1蛋白通過依賴劑量的方式來特異性地抑制流感病毒mRNA的積累。這種抑制活性的部位位于M1蛋白的的氨基端。 M2整合膜蛋白是A型流感病毒子里含量少卻很重要的成分,是一個由97個氨基酸殘基組成的同寡聚體,由一對二硫鍵或全部由二硫鍵相連,形成一單一穿膜結構域,豐富地表達在A型流感病毒感染的細胞表面,病毒子內M2蛋白表達很少。M2蛋白位于膜內,包括由N端24個氨基酸殘基組成的胞外區、19個氨基酸殘基組成的TM區、54個氨基酸殘基組成的胞漿尾。其生物活性式為寡四聚體L14l。四個單體組成離子通道穿孔區。M2蛋白在內核體里的病毒子脫核衣殼時發揮離子通道的作用,促使離子進入病毒子,解除蛋白質之間的相互作用,主要削弱基質蛋白M1與核衣殼蛋白(NP)之間的作用。此外,M2蛋白通過胞吐途徑的運輸可平衡胞漿和TGN(trans-Goginetwork)腔內的pH值。 M2胞漿尾可能有多種功能,除了維持離子通道活性外,對與病毒子的其他蛋白質之間的相互作用也是很重要的,特別是對M1蛋白。反向遺傳學研究表明,M2蛋白胞漿尾被刪去5個或10個氨基酸殘基后,就會失去拯救流感病毒的能力。然而,盡管失去拯救病毒的能力,離子通道的活性變化和蛋白之間的相互作用沒有差別。M2蛋白離子通道活性可被抗流感病毒藥物(amantadine)特異性地阻抑,在內核體和TGN腔的低PH環境下又會被激活。

6 非結構蛋白 非結構蛋白(Nonstructure protein,NS)由片段8編碼,共編碼兩種多肽NSl、NS2。 NSl蛋白主要存在于感染細胞的核內。Geenspan等(1988)發現,NSl蛋白含有兩個核定位信號區,其中34~38位氨基酸殘基處的信號區非常保守,在所有A型流感病毒中都相同,其氨基酸排列順序為-ASP-ARG-LEU-ARG-ARG-。第二個信號區在203~237位氨基酸殘基處,在大多數A型流感病毒中都有這一序列。不同亞型毒株的NSl在帶電性和磷酸化方面有很大的差異。 NSl作為IFN的拮抗劑與A型流感病毒的致病性有關。A型流感病毒的高致病性毒株可能是通過NSl蛋白的進化來更加有效地抑制IFN介導的抗病毒效應。NSl可能是通過連接(和隔絕)dsRNA來抑制IFN介導的抗病毒反應。NSl蛋白在體外可通過dsRNA來抑制PKR的激活。缺少NSl基因的流感病毒可能是一種更好的IFN誘生劑,可通過刺激一種抗病毒狀態來抵抗各種感染性因子。A型流感病毒NSl蛋白作為一種IFN拮抗劑,可能是將來研究新型抗病毒化合物的好材料。 NS2大量存在于感染細胞中胞漿內,但也可在細胞核內發現,可能在病毒復制過程中起一定的作用,還可能有調節非結構蛋白合成的作用。NS2合成較晚。具體的一些功能還沒有徹底搞清楚。

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