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葡萄無病毒母本樹和苗木 Virus-free mother plant and nursery stock of grapevine

時間:2013-09-03 11:23:28  來源:  作者:

標準類別  NY/T 農業行業推薦標準
標準名稱  葡萄無病毒母本樹和苗木 Virus-free mother plant and nursery stock of grapevine

標準分類  種植業->水果蔬菜及制品
標準號  NY/T 1843—2010

頒布部門  中華人民共和國農業部

頒布日期  2010-05-20

實施日期  2010-09-01

關鍵字  葡萄、無病毒、母本樹、苗木
標準內容  
1  范圍

本標準規定了葡萄無病毒母本樹和苗木的質量要求、檢驗規則、檢測方法、包裝和標識。

本標準適用于葡萄無病毒母本樹和苗木的繁育及銷售。

2  規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用于本標準,然而,鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標準。

 NY 469  葡萄苗木

全國農業植物檢疫性有害生物名單(農業部公告第617號,2006年3月)

3  術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

3.1  葡萄無病毒原種  virus-free primary source of grapevine

通過脫毒處理或無性系篩選獲得、經單株檢測無病毒后隔離保存的原株。

3.2  葡萄無病毒母本樹  virus-free.mother plant of grapevine

葡萄無病毒原種材料繁育的、用于提供品種或砧木繁殖材料的無病毒母株。

3.3  葡萄無病毒砧木  virus-free rootstock of grapevine

從無病毒砧木母本樹上取得繁殖材料、經扦插或通過組培獲得用于嫁接的葡萄砧木苗。

3.4  葡萄無病毒接穗  virus-free scion of grapevine

從無病毒母本樹上獲得的、用于嫁接繁殖的當年生新梢或一年生成熟枝條。

3.5  葡萄無病毒苗木  virus-free nursery stock of grapevine

用無病毒接穗和無病毒砧木繁育的葡萄嫁接苗,以及通過扦插、組織培養等方法繁育的葡萄自根苗。

4  要求

4.1  葡萄無病毒母本樹和苗木無葡萄扇葉病毒(Grapevine fanlcaf virus,GFIV)、葡萄卷葉病毒1(Grapevine leafroll associated virus 1,GLRaV-1)、葡萄卷葉病毒3(Grapevine leafroll associated virus3,GLRaV-3)、葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)和葡萄斑點病毒(Grapevine fleck virus,GFkV)。

4.2  無《全國農業植物檢疫性有害生物名單》(農業部公告第617號,2006年3月)規定的檢疫性有害生物。

4.3  品種純正、生長健壯。

4.4  葡萄無病毒自根苗和嫁接苗的質量符合NY 469的規定。

5  試驗方法

5.1  葡萄無病毒原種

5.1.1  葡萄無病毒原種栽培容器中保存于防蟲網室或防蟲溫室中,每個品種5株。每株原種均有編號、來源和病毒檢測記錄。

5.1.2  每年生長季節觀察樹體狀況,發現有病毒病癥狀的植株,立即淘汰并銷毀。

5.1.3  每5年全部復檢一次,帶病毒植株立即淘汰并銷毀。

5.1.4  病毒檢測采用指示植物結合酶聯免疫吸附(ELISA)或反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法進行。

5.2  葡萄無病毒母本樹

5.2.1  葡萄無病毒母本樹栽植于沒有傳毒線蟲、6年之內未栽植過葡萄的地塊,與普通葡萄園和苗圃的距離大于60m,修剪工具、生產工具及農機具專管專用,并定期消毒。

5.2.2  每個生長季節觀察樹體狀況,并抽取5%~10%的母本樹進行病毒檢測。發現有病毒病癥狀的植株和檢測帶病毒的植株,立即淘汰并銷毀。

5.2.3  病毒檢測采用ELISA或RT-PCR方法進行。

5.3  葡萄無病毒苗木

5.3.1  葡萄無病毒苗木應在距離普通葡萄園或苗圃30m以上、沒有傳毒線蟲且在3年內未栽植過葡萄的地塊進行繁殖,修剪工具、生產工具及農機具專管專用,并定期消毒。

5.3.2  采用隨機取樣方法抽取苗木進行病毒檢測。以1萬株抽檢10株為基數(不足1萬株以1萬株計),10萬株內(含10萬株)每增加1萬增檢5株;超過10萬株,每增加1萬增檢2株。

5.3.3  病毒檢測采用ELISA或RT-PCR方法進行。

5.3.4  等級規格檢驗按NY 469規定執行。

6  檢驗規則

6.1  指示植物檢測

6.1.1  葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒、葡萄病毒A和葡萄斑點病毒均可采用指示植物進行檢測。

6.1.2  用綠枝嫁接、硬枝嫁接或芽接方法,將待檢樣品嫁接到指示植物上,每個樣品重復3株。

6.1.3  生長季節定期觀察指示植物的癥狀表現,檢測用指示植物和癥狀表現參見附錄A。

6.2  ELISA檢測

6.2.1  葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒1、葡萄卷葉病毒3、葡萄病毒A和葡萄斑點病毒可采用ELISA方法進行檢測。

6.2.2  取樣部位和時間參見附錄B。

6.2.3  ELISA檢測具體操作方法參見試劑盒使用說明。

6.3  RT-PCR檢測

6.3.1  葡萄扇葉病毒、葡萄卷葉病毒、葡萄病毒A和葡萄斑點病毒均可采用RT-PCR方法進行檢測。

6.3.2  取樣部位和時間參見附錄B。

6.3.3  檢測程序參見附錄C。

7  標識和包裝

7.1  標識

7.1.1  葡萄無病毒母本樹標簽內容包括品種名稱、砧木類型、母本樹編號、病毒檢測單位和檢測時間、母本樹培育單位。每捆掛2個標簽。

7.1.2  葡萄無病毒苗木標簽內容包括品種、砧木、等級、株數、生產單位和地址。每捆掛2個標簽。

7.2  包裝

分品種、種類(母本樹、自根苗、嫁接苗)和等級,分別定量包裝,每捆20~30株為宜。注意苗木保濕。包裝內外附有苗木標簽,不應與普通苗木混裝。

采用二氧化硅吸附法:(1)刮取100mg枝條韌皮部組織放入塑料袋中,加入1mL研磨緩沖液(4.0mol/峨氰酸胍,0.2mol/L醋酸鈉,25mmol/L EDTA,1.0mol/L醋酸鉀,2.5%PVP-40,2%偏重亞硫酸鈉)磨碎;(2)取500μL勻漿置于1.5mL消毒離心管中(先加入150μL 10%N-lauroylsar-cosine),70℃保溫10min、冰中放置5min后,14000r/min離心10min;(3)取300μL上清液,加入150μL 100%乙醇、300μL 6mol/L碘化鈉、30μL 10%硅懸浮液(pH2.0),室溫下振蕩20min;(4)6000r/min離心1min,棄去上清,加入500μL清洗緩沖液(10.0mmol/L Tris-HCl,pH7.5;0.5mmol/LEDTA;50.0mmol/L NaCl;50%乙醇)重懸浮沉淀,6000r/min離心1min;(5)重復步驟(4);(6)將離心管反扣在紙巾上,室溫下自然干燥后,重新懸浮于無RNase和DNase的水中,70℃保溫4min;(7)13000r/min離心3min,取上清液,保存于-70℃超低溫冰箱中。

C.2  合成cDNA

5μL總RNA與1μL 0.1μg/μL隨機引物5’d(NNN NNN)3’和9μL水混合,95℃變性5min后立即置于冰中冷卻2min。再加入含5μL 5×MLV-RT緩沖液、1.25μL 10mmol/L dNTPs、0.5μL200 U/μL M-MLV反轉錄酶和3.25μL滅菌純水的反轉錄混合液,經37℃10min、42℃50min、70℃5min合成cDNA。

C.3  PCR擴增

PCR反應混合液共25μL,包括2.5μL cDNA、2.5μL 10×PCR緩沖液、0.5μL 10 mmol/L dNTPs、0.5μL 10μmol/L互補引物、0.375μL 2U/μL Taq DNA聚合酶、18.125μL滅菌純水。PCR反應條件根據各組引物的退火溫度及擴增產物大小設計。

C.4  結果判定

檢測時設陰、陽對照,采用1%瓊脂糖電泳分析PCR產物,觀察到與陽性對照相同的目的條帶的樣品為陽性,帶病毒;與陰性對照一樣,未觀察到目的條帶的樣品為陰性,無病毒。

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