養殖與種植專家-農業戶網
>您當前的位置:首頁 > 保鮮
推薦保鮮文章

抗凍蛋白及其在果蔬保鮮中的應用前景

時間:2014-10-01 17:01:04  來源:  作者:

抗凍蛋白(AntifeezeProteins,AFPs)是一類抑制冰晶生長的蛋白質,能以非依數性形式降低水溶液的冰點,但對熔點影響甚微,從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現差異。這一現象被稱為熱遲滯現象。因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(Thermal Hysteresis Proteins,THPs)。抗凍蛋白的抗凍活性(Antifreeze Activity)亦稱熱滯活性(Thermal Hysteresis Activity,THA)被定義為其水溶液冰點與熔點之差值,差值愈大,活性愈強。AFPs于1969年由A.L. Devries在南極Mcmurdo海峽的一種魚(Nototheneniid)的血液中首次發現,它能阻止體液內冰核的形成與生長,維持體液的非冰凍狀態。這一發現引起了許多實驗室的研究興趣,研究對象從極區魚擴展到昆蟲,最后又擴展到植物,甚至微生物。科學家發現,原來AFPs在生物界廣泛存在,是生物適應低溫、抵御凍害的一種機制。人們試圖分離純化活性高的抗凍蛋白,并對它的基因及轉基因研究,以期望將它用于改良某些生物的抗凍性能。這些研究對抗凍蛋白及其基因的結構、功能和作用機理有了較為深入的了解,并為抗凍蛋白的應用打下了良好的基礎。隨著人們生活水平的提高,果蔬鮮食比例呈增長趨勢,果蔬保鮮是近年來的一個研究熱點。

1 抗凍蛋白的特性

1.1 熱滯效應(Thermal Hysteresis Action) AFPs具有特殊的熱遲滯性質,即其溶液的冰點低于熔點,是AFPs最基本的特性。AFPs降低魚血清,昆蟲、植物體液或水溶液冰點的效率比一般溶質要高,按重量濃度算比NaCI的效率高2倍;按摩爾濃度算,比NaCl的效率高200-500倍。說明AFPs降低體液冰點的機制與鹽類(如NaCl)不同。一般溶液(如NaCl,蔗糖溶液等)的冰點是固、液兩相蒸汽壓平衡時的溫度,因而冰點等于熔點。而AFPs在其溶液中只影響結冰過程,幾乎不影響熔化過程,所以使冰點低于熔點。例如2%抗凍糖蛋白溶液-0.9℃結冰,而結的冰直至溫度上升至-0.02℃也不熔化。熱滯是一種非理想溶液的行為,溶液的冰點下降是非依數性的,而其熔點的差值稱為熱滯值。在熱滯中所謂的冰點并不是真正的冰-水平衡相變點,而是冰晶生長點。熱滯值實際上是熔點與冰晶生長點之差值。AFPs的抗凍機理主要是由于冰晶與溶液的界面自由能的增加導致當溫度從相變點進行降低-定值時,整個系統的自由能并不減少,從而防止冰晶生長,導致熱滯現象。Raymond等(1972)首先提出熱滯定量理論,并給出熱滯公式,指出熱滯值的大小與AFPs溶液濃度和AFPs的分子質量呈正相關,但不是線性相關。李前忠等(1994)提出抗凍蛋白熱滯值的經驗計算公式,所得結果與實驗數據較好吻合。

1.2 冰晶形態效應 AFPs有抑制冰晶生長的作用,而且這種作用在不同的方向上有強弱之分,因而引起冰晶形態的改變。在純水中,冰通常以平行于晶格基面(a軸)的方式生長,而在垂直于基面的方向(c軸)很少生長,故冰晶格看起來呈扁圓狀。在含有抗凍蛋白溶液中,隨著抗凍蛋白的濃度(μmol/1)的增加,冰晶的形態由原來的橢圓形變為六棱錐狀至針狀。低濃度AFP優先抑制冰晶沿a軸的實質,因此冰晶格的六邊柱表面變得明顯。高濃度AFP條件下,冰晶主要沿c軸生長而形成六邊雙棱錐及針形晶體。有關抗凍蛋白與冰晶作用機理先后有人提出結合水學說、表面結合學說、吸附一抑制學說等。就目前研究來看,吸附一抑制學說比較合理,但是解釋AFPs吸附冰晶抑制其生長的理論依據尚不完善。吸附-抑制學說首先由Ramond和Devries于1977年提出,這一機理假設抗凍蛋白分子的氫鍵鍵合于冰晶晶格上,通過Kelvin效應抑制其生長。這一模型被后來的一些實驗所證實和補充。1988年Yang等人首次分析了Winter flounder中類型工抗凍蛋白的晶體結構以后,對抗凍蛋白如何吸附到冰晶體上提出了具體假設,認為由于這種蛋白的雙親螺旋結構形成了雙電極現象。由此誘導冰晶的水分子形成雙極結構。沿螺旋面通常具有極性氨基酸(如Thr、Ash、Asp)的空間排列,極性殘基(特別是Thr)鍵合于冰晶上,使抗凍蛋白吸附于冰晶上,在抗凍蛋白的另一面呈現相對液態水的疏水柱,從而抑制冰晶的生長。Wen等人采用蛋白類比和冰晶侵蝕的研究建立了抗凍蛋白和冰晶作用的模型。通過這一模型模擬了由Winter flounder中提取的抗凍蛋白與冰晶作用的情況,結果說明,該蛋白確實以特殊形式在Thr、Asn和Asp側鏈上以氫鍵鍵合于冰晶的六棱體雙錐平面上,從而抑制冰晶的生長。此模型進一步假設鍵合是非定向地以盡量大的機會將抗凍蛋白的分子堆于冰面上,冰晶生長的抑制是通過兩個作用過程進行的,即氫的鍵合作用過程和疏水的蛋白內部分子的相互作用過程,這較好地解釋了抗凍蛋白溶液在低濃度時冰晶沿六棱體雙錐面緩慢生長,當達到臨界濃度時,由于抗凍蛋白分子堆在一起,內部分子間相互作用,大大增加了鍵合和活性,冰晶停止生長,只有達到其冰點時,冰晶沿c軸方向快速生長,形成針狀冰晶,抑制它在其他方向的擴展。Chou利用Monte Carlo模擬和能量極小化冬鱈抗凍蛋白結構和抗凍機理,提出冬鱈抗凍蛋白是通過四個Thr側鏈氫鍵與冰晶中沿著(OIT2)方向的氧原子產生相互作用,從而抑制冰晶的生長。Knignt等通過實驗提出抗凍蛋白AFGP7、AFGPs通過雙糖與冰晶形成氫鍵吸附到冰晶表面,從而抑制冰晶的生長。

1.3 抑制冰的重結晶 所謂重結晶是指在已經形成的冰晶體顆粒大小的重新分布,即一些冰晶增大,而另一些減小,并且大的冰晶愈長愈大,小的越來越小,直至消失。這種情形主要是由溫度波動引起,對動植物組織尤其是植物組織因冰晶體的增大而產生嚴重的機械損傷。而AFPs具有抑制重結晶發生的作用,所形成的晶粒體積小而且比較均勻。自1992年加拿大Griffith第一次從冬黑麥中獲得植物AFPs以來,已先后從凍大麥、小麥燕麥、沙冬青和胡蘿卜等質外體中獲得AFPs。這些AFPs在體外水溶液中均表現出典型的熱滯響應和重結晶抑制活性。在耐凍植物內和耐冰昆蟲(僅限于細胞外結冰)體內,重結晶抑制作用可能比熱滯效應更為重要。在植物體內AFPs的熱滯值通常為0.2℃-0.6℃,靠此來降低冰點,避免結晶的作用是很小的。AFPs主要通過重結晶抑制作用來避免冰晶體對細胞組織的傷害,因為重結晶化的抑制作用比冰晶生長的抑制作用更容易達到,只需少量AFPs(20μg/ml),就有較高的重結晶化抑制活性。

1.4 調節動植物原生質體的過冷狀態,使過冷點降低 許多寒冷地區昆蟲和植物能在-25℃以下的環境下生存,免于冰凍傷害,僅依靠AFPs的熱滯效應來降低冰點是不能解釋的。事實上,它們抗凍性的提高是依靠原生質體的過冷作用,這可能暗示著AFPs在生物體內的抗凍作用不僅是降低冰點,更重要的作用是調節原生質溶液的過冷狀態,使過冷點降低。這一推斷基于以下實驗結果:①AFPs的合成和過冷點的降低具有時間上的一致性,AFPs的變化和魚類、昆蟲的過冷點變化一致性似乎表明這個推論是成立的,例如昆蟲Weracantha contracta的體液,在二月份當地氣溫最低時,體液過冷點最低,AFPs積累量也最大;隨著氣溫回升,過冷點也增高,AFPs積累減少。②AFPs活性和冰核蛋白(促進冰晶生長的蛋白)的活性變化呈相反的趨勢。Olsen和Duman比較冬季和夏季D.canadensis血淋巴冰核蛋白和AFPs的活性變化發現,冬季冰核蛋白的活性降低,夏季升高,而AFPs活性則正好相反。③AFPs能降低冰核蛋白的活性。冬季D.canadensis血淋巴具有抗凍活性,這種血淋巴能抑制自身的脂蛋白冰核劑活性。同時從這種血淋巴中能純化出的AFPs也能抑制體內的冰核蛋白活性。由此可以推測,AFPs在昆蟲體內的一個重要作用在于通過調整體液或原生質的狀態,如與多元醇類等依數性抗凍劑協同作用、抑制冰核蛋白活性作用等,使溶液達到一種過冷態、從而降低過冷點。推測植物AFPs可能也有類似的功能,否則越冬植物就不可能在遠低于冰點的低溫環境中生存。這是基于一些相關的實驗結果的推斷,并沒有直接的實驗證據。 此外,AFPs還可以抑制玻璃化損傷,這也許通過阻斷Ca2+和K+離子通道達到對細胞膜的保護作用。

2 抗凍蛋白的結構與功能

2.1 魚類的抗凍蛋白 目前已了解的魚抗凍蛋白大致可分為四類:抗凍糖蛋白(AFGPs),工型抗凍蛋白(AFPl),Ⅱ型抗凍蛋白(AFPⅡ),及Ⅲ型抗凍蛋白(AFPⅢ)它們在分子結構上各異,其中研究得較詳細的是I型抗凍蛋白。

2.1.1 AFGPs 主要存在于生活在兩極的某些魚類中,如齒魚類(Dissostichus)、貝氏肩鲞(Trematomus bernacchii)及北半球高緯度海域中的魚如大西洋鱈(Gadus morhua)、北鱈(Boreogadus Saida)的血液中。最初是在Antarctic nototheniid中發現,AFGPs是一種含雙糖的三肽聚合體,多肽是由(Ala-Ala-Thr)。三肽重復單位組成,n為4~50;雙糖為β-D-半乳糖與2-乙酰氨基-2-脫氧-α-D半乳糖通過β1-3鍵連接,雙糖以。糖苷鍵連接于蘇氨酸殘基的羥基上,在C端接1~2個Ala,根據重復數n的多少形成一系列分子質量在2.5~37.7KDa的抗凍蛋白。糖基是決定抗凍性的主要基團,因為化學修飾(乙酰化和過氧化)糖基后會導致抗凍活性的消失。二糖結構中順式構象的相鄰羥基對THA至關重要。當二糖為半乳糖時,C3、C4位上的羥基為活性基團。實驗表明,這類抗凍糖蛋白的活性與分子量有關,分子量大者,一般活性也高。Davis等推測,AFGPs在溶液中以左手-折疊螺旋存在,所有的雙糖基團處于分子同一側,而相對疏水的丙氨酸基團處于另一側。經NMR分析表明,雙糖的親水基團與水分子形成氫鍵,阻止冰晶的生成。

2.1.2 AFP工 在美州黃蓋鰈魚(Pseudop1e-uronectus arnericanus)、床杜父魚(Myaxocephalus scorpius)等中存在。分子量3.3-4.5KDa,富含丙氨酸,但無糖基。目前對Winterfiouder的抗凍蛋白研究最為深入,其一級結構是由11個氨基酸殘基組成的多肽單元,(Thr-(Alx)2-Asx-(Alx),-)重復串聯而成,這其中Alx主要為丙氨酸,占總氨基酸的60%以上。間或有些利于α螺旋形成的非極性氨基酸如Leu,lys等,而Asx則為Asp或Asn。通過X射線研究其晶體結構,發現其一級結構具有單一的α-螺旋結構,這種蛋白的一級結構決定其二級結構則形成相應的雙親螺旋結構(amphiphilic),即親水性氨基酸側鏈位于螺旋軸的一側,疏水性氨基酸側鏈位于另一側。從而形成這種雙親現象。其親水性氨基酸具有較大的擺動性,這樣可以粘附到不同的冰晶體表面,促進與冰晶體結合,從而抑制冰晶生長,該結構有較好的熱穩定性,Asn/Asp的比例和蘇氨酸是影響其抗凍活性的主要因子。

2.1.3 AFPⅡ 存在于美絨杜父魚(Hemitrip-terusarnericanus),彩虹胡瓜魚(Osmerusmordax),大西洋鯡(Clupeaherengus),分子量14~16 KDa,是目前唯一的在蛋白質序列中查出與其他蛋白具有同源性的一類蛋白,與動物C型凝集素同源,AFPⅡ的特點是不含糖類,富含半胱氨酸,其中50%的Cys能形成二硫鍵,這些二硫鍵對保持分子結構穩定性及抗凍活性有重要的作用。巰基乙醇或二硫蘇糖醇處理會導致THA喪失。它們最初是在Sea raven魚中發現的,對其脫氧核糖核酸(cDNA)序列分析及根據cDNA轉譯氨基酸順序的分析表明該種成熟的抗凍蛋白可能來自一個大約163個氨基酸長的前體蛋白有129個氨基酸長的多肽,其二級結構是由一個少量α-螺旋和β-折疊以及大量轉角結構組成,并有一個折疊的三級結構,1991年又在昆蟲Tenebrio molitor和Dendroidea canadensis中發現這類蛋白。

2.1.4 AFPⅢ 主要存在于綿亞科魚類。首先在魚Ocean pout中發現AFPⅢ,其中8個AFPs從大洋條鱈中分離出來,和AFPⅡ一樣,AFPⅢ是一種球狀結構的蛋白分子,但它們既不富含Ala,又不富含Cys,分子質量約6KDa,用NMR和X-射線衍射技術分析表明,其二級結構主要由9個β-折疊組成,其中8個組成一種β-折疊三明治夾心結構,另一個β-折疊則游離在其外,這種三明治的"夾心"就是兩個反向平行的3個串聯β-折疊,其外邊是兩個反向平行的β-折疊。β股之間有親水域(4~8A)可與冰表面結合。

2.1.5 AFPⅣ 是最近Deng等1987年從多棘麻杜父魚(Myoxocephalus octodecimipinosis)的皮膚中純化出的一種新型AFPs,大約108個氨基酸殘基。在其N端連接有一個焦谷氨酸酰基團,并且含有高達17%的Glu。該蛋白和膜載脂酰蛋白具有22%的同源性。圓二色譜分析表明該蛋白和載脂酰蛋白結構類似,有較高的α-螺旋結構,其中4個α-螺旋束反向平行排列,疏水基團向內,親水基團向外,這些親水基團可能和冰晶表面結合。推測這種蛋白阻止冰晶體從皮膚表面滲入。

2.2 昆蟲的抗凍蛋白 昆蟲抗凍蛋白(AFPs)的分子量一般為8~20KD,無糖基,與魚類I型AFPs相似,含有較多的親水性氨基酸(例如Thr,Ser,Asx,Glx,Lys,Arg),有40%~59%的氨基酸殘基能形成氫鍵。有些昆蟲AFPs類似于魚類Ⅱ型AFPs,含有一定數量的半胱氨酸。和魚類、植物AFPs相比,昆蟲AFPs具有更高的抗凍活性和獨特的化學結構特征,Graham等從黃粉甲(Tenebriomolitor)的血淋巴中分離出一種AFP,其熱滯活性是魚類的100多倍,富含Thr和Set,分子量約8.4KD,一級結構由12個氨基酸的重復序列組成。Duman等從D.danadesis中分離出2種AFPs,DAFPl和DAFP2,分子量約8.7 KD,分別含83處84個氨基酸殘基。它們組成7個含12或13個氨基酸殘基的重復單元。每6個殘基中有一個半胱氨酸,因此富含二硫鍵,這些二硫鍵使DAFPI和DAFPⅡ結構穩定,能耐受100℃的高溫。用DTT處理,減低這些二硫鍵,或使游離羥基烷基化,AFPs隨之失去活性。云杉卷葉蛾(Choristoneura famiferana)與魚類(如美州絨杜文魚Hemitripterus americanue)Ⅱ型AFPs有免疫交叉反應,說明這些魚類和昆蟲的AFPs有共同的抗原決定簇。

2.3 植物抗凍蛋白 植物抗凍蛋白研究起步較晚。絕大多數已研究的植物材料中,抗凍蛋白活性(熱滯值通常為0.2~-0.5℃)大大低于魚類(0.51~1.5℃)和昆蟲(3~6℃。1992年加拿大的Griffith等首先從冬黑麥非質體中分離到7個AFPs,具有相似的氨基酸組成。Hon等LNj證明這7個AFPs中有3個AFPs的N-端序列與3種抗真菌蛋白(內切幾丁質酶、β-1、3葡聚糖酶及甜蛋白類似蛋白)具有同源性,經免疫檢測表明,它們分別是幾丁質酶,β-1,3葡聚糖酶和甜味蛋白類似蛋白。這說明冬黑麥中抗凍和抗病反應可能有著共同的或相似的反應體系。從強抗凍植物沙冬青(Ammopitanthus mongolicus)葉片中分離出熱穩定的AFPs,其中一種抗凍糖蛋白,測定其N端20個氨基酸的序列,表明它和植物凝集素有同源性。從這些研究結果來看,AFPs可能具有多重功能,既具有抗凍活性同時又有酶(如幾丁質酶、13-1,3葡聚糖酶)、或抗菌(如甜味蛋白)、抗蟲活性(植物或動物凝集素)。

3 抗凍蛋白在果蔬保鮮中的應用前景 抗凍蛋白的特性在20世紀60年代末報道后,美、加、英等國很多學者紛紛尋找它的應用,但抗凍蛋白只能很小限度的降低冰點,與常用的可食用的抗凍劑相比,效果不顯著,且自然生產量很小,因此充分運用到食品中去條件不成熟。基因工程的發展為抗凍蛋白的應用提供了良好的條件,即運用基因過程的方法把異源的高活性的AFP的基因轉移到目標果蔬上,使之表達。這種遺傳特性的改良,從根本上增強果蔬在田間的抗寒能力,而且會改善果蔬采后的貯藏加工特性。新鮮果蔬貯藏時均需有適宜的最低溫度,低于此溫度常造成果蔬的冰害和凍害。適宜低溫點的選擇往往取決于貯藏對象的耐低溫能力。貯藏溫度若能降低1℃,就可以明顯延長某些果蔬的貯藏壽命。 速凍果蔬在凍藏解凍過程中常出現的主要問題是汁液流失(drip loss)、軟爛、失去原有的形態。造成汁液流失的原因與食品的原料處理、凍結方式、包裝、凍藏條件以及解凍方式有關,最關鍵的因素是凍藏過程中的溫度波動導致重結晶。能表達AFPs的轉基因蔬菜可改善這種狀況,提高速凍品的質量。這是因為轉基因蔬菜在凍結與凍藏中冰晶對細胞和蛋白質的破壞很小,合理解凍后,部分融化的冰晶也會緩慢滲透到細胞內,在蛋白質顆粒周圍重新形成水化層,使汁液流失減少,保持了解凍食品的營養成分和原有風味。 人們將魚的AFP I抗凍蛋白滲入到植物葉和莖的組織中使其冰點降低了1.8℃以上,在植物懸浮培養細胞低溫保存時,抗凍蛋白可起到冰凍保護劑一樣的作用,而抗凍蛋白也能降低植物細胞內冰晶形成速度,這表明魚抗凍蛋白在植物中具有抗凍活性。AFP廣泛應用的主要問題為其來源和成本,許多科學家嘗試用低廉的細菌來定向生產AFP,蔣耀青等將黃蓋鰈AFP基因(CDNA)轉入大腸桿菌,用ELISA方法檢測了其表達活性。Sun等從生長在加拿大北極地區的植物的根際分離到一種根瘤(Pesudomonasputida GRl2-2)。該細菌能在冬春季5℃低溫條件下增殖并能促進菜油(Brassicanapus)根系的伸長。不僅如此,該菌還能度過-20℃和-50℃的冰凍溫度而存活下來。在研究其抗凍機制的過程中發現,該菌在其后的5℃生長溫度下,會合成和分泌一種具有抗凍活性的蛋白質,通過對細菌生長介質的分離、提純和鑒定,獲得一種分子量在32000~34000KDa之間的主要蛋白質和許多小蛋白組分,但未弄清楚究竟是哪一種蛋白質分子具有抗凍活性。Sun的工作給人一種希望,因為用細菌來生產細菌本身的抗凍蛋白不存在表達障礙問題。 基因工程技術的發展,為利用因過程技術將抗凍蛋白基因導入植物中以得到高水平的表達,由此獲得抗凍的植物品種有著誘人的前景。1998年10月英國York大學的Dawn等誘導純化了胡蘿卜AFPs并得到了其基因,標志著第一個植物AFPs基因的發現。這種在胡蘿卜的直根中誘導表達,分子質量為36ku的抗凍蛋白,是一種糖蛋白,體外熱滯值0.35℃,去掉糖側鏈并未影響其抑制重結晶的活性。其cDNA全長1140 bp,DNA全長1238 bp,編碼332個氨基酸。cDNA轉到煙草中表達,結果在正常溫室環境生長的煙草中抗凍蛋白得到積累。在此之前,只有魚類4種AFP的基因結構研究得較為清楚,昆蟲和植物一無所知。因此人們從事AFP基因工程的目的基因只有來源于魚類。 Georges等根據美洲黃蓋鰈魚的I型抗凍蛋白的基因序列,合成了一個包括21氨基酸信號肽及37氨基酸成熟抗凍蛋白的基因,轉入到玉米的原生質體中,并已表達。Mueller等合成了編碼由2個至6個重復11氨基酸序列的一系列工型抗凍蛋白基因轉入番茄中表現出重結晶的抑制活力。美國DNA工程公司在番茄中導入抗凍蛋白基因,降低了細胞內水分的凝固,培育出的耐寒番茄,在-6℃能生存幾個小時,果實冷藏后不變形。 目前,植物抗寒基因工程取得了一定進展,但是這方面的研究僅剛開始,還有許多需要深入的研究探討。例如在昆蟲體內存在的熱滯蛋白可降低冰點大6℃,而魚的抗凍蛋白一般降低冰點2℃左右,但昆蟲抗凍基因的克隆極其植物基因工程的工作尚未開展。隨著植物抗寒基因工程研究的不斷深入。生物合成AFPs的成本會大大下降,使AFPs用于果蔬商業化保鮮成為可能。同時,更多的耐寒果蔬將被獲得。到那時,人們將在市場上買到品種繁多,品質優良的新鮮果蔬。當然,要實現這一美好的愿望,還有許多問題要解決,這包括技術上、安全上和經濟上等一系列問題。

    共有條評論發表評論
    用戶名: 密碼:
    驗證碼: 匿名發表
    CopyRight 農業戶 http://www.vvouax.live 版權所有
    吉ICP備11001780號-1
    体彩快乐扑克投注